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撰文：之文

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年3月18日，法国蒙彼利埃大学CatherineCurie研究团队在ThePlantJournal学术期刊发表了题为“Manganesetriggersphosphorylation‐mediatedendocytosisoftheArabidopsismetaltransporterNRAMP1”的研究论文，该研究发现锰诱导NRAMP1的20，22，24位丝氨酸（Ser）磷酸化，进而促进NRAMP1的内吞作用，揭示了锰调控金属转运蛋白NRAMP1在细胞质膜和内膜系统的动态循环的机制。

研究背景

锰是植物生长所必需的一种微量元素，由于高pH或一些微生物活动使得土壤中锰的有效性降低，导致植物光合作用和抗病性降低等缺锰表型，而土壤低pH也会对植物造成毒害，抑制植物的生长。锰有效性低时，植物在NRAMP（NaturalResistanceAssociatedMacrophageProtein）家族等金属转运蛋白协助下进入细胞，之前CatherineCurie等研究组发现拟南芥NRAMP1是一个定位于根尖细胞质膜的高亲和锰转运蛋白，介导锰有效性低时锰进入细胞内的转运，但是外界锰供应的变化只是轻微影响NRAMP1表达，却显著改变NRAMP1的活性和植物体内锰的积累，暗示着NRAMP1存在转录后、翻译水平或翻译后水平上的修饰。

主要研究结果

1.锰的供应影响NRAMP1的膜定位该研究利用nramp1突变体表达35S:NRAMP1-GFP的转基因植物（NRAMP1-GFP）检测NRAMP1的亚细胞定位和蛋白积累量，免疫印迹结果显示缺锰和过量锰条件并不影响NRAMP1的蛋白量。GFP荧光蛋白追踪NRAMP1的亚细胞定位发现，缺锰时NRAMP1-GFP的荧光信号主要定位在细胞质膜，随着锰供应量的升高，NRAMP1-GFP在细胞质膜上的荧光信号减弱，转移到内膜系统的荧光信号增强（图1），说明NRAMP1-GFP响应外界锰的供应。进一步研究发现，从缺锰转移到锰充足条件，NRAMP1-GFP与反式高尔基/早期内体(TGN/EE)标志mCherry-VTI12的荧光信号高度共定位，与多囊体(MVB)标志mCherry-ARA7的荧光信号部分共定位。说明植物为了响应锰的供应，NRAMP1在细胞质膜与内膜系统之间动态循环。2.干扰网格蛋白介导的内吞作用阻碍NRAMP1的细胞内化植物中的内吞作用主要由网格蛋白介导，AUXILIN是网格蛋白的脱帽因子，过量表达AUXILIN-LIKE2可以通过阻碍网格蛋白招募到细胞质膜来抑制由网格蛋白介导的内吞作用。该研究将AUXILIN-LIKE2过量表达在NRAMP1-GFP转基因植物中，发现高锰条件下NRAMP1-GFP与细胞质膜染料FM4-64荧光信号共定位，说明锰供应调控NRAMP1在细胞质膜和内膜系统的动态循环依赖于网格蛋白介导的内吞作用。图1锰的供应影响NRAMP1-GFP的膜定位3.磷酸化调控NRAMP1-GFP的内吞作用已有研究报道，磷酸化等翻译后修饰诱导细胞质膜蛋白的穿梭。NRAMP1含有9个磷酸化位点，N-端20、22和24位丝氨酸（Ser，S）形成一个磷酸化位点簇，质谱数据也直接证明20和22位Ser可以被磷酸化，为测试S20、S22和S24磷酸化对NRAMP1功能的影响，将S替换为丙氨酸A(S20,22,24A)模拟不能磷酸化的状态，将S替换为天冬氨D(S20,22,24D)模拟磷酸化状态，不同锰供应条件下，NRAMP1S20,22,24A-GFP均定位在细胞质膜，而NRAMP1S20,22,24D-GFP均定位于内膜系统（图2），说明20和22位S的磷酸化调控NRAMP1-GFP的内吞作用。图2磷酸化位点替换后NRAMP1-GFP的亚细胞定位4.NRAMP1的动态循环保护植物对抗锰毒为了测试干扰锰介导NRAMP1的内吞作用是否影响植物体锰的同化，将S20,22,24A和S20,22,24D与GFP融合的构建转基因到植物中，只有NRAMP1S20,22,24A-GFP转基因植物的叶片在锰充足条件下呈现出皱缩和白色叶脉的表型，缺锰条件并不出现这种表型（图3），说明NRAMP1稳定表达在细胞质膜时导致植物对过量锰的耐性降低，也反映了NRAMP1的动态循环是植物确保合适的锰吸收和阻止锰毒的一种有效方式。图3磷酸化位点替换后转基因植物的表型5.S20的磷酸化调控NRAMP1的内吞作用该研究最后测试了S20、S22和S24单独替换为A时，锰供应对NRAMP1膜定位的影响，只有S20A能将NRAMP1稳定表达在细胞膜上，而S22A和S24A不能（图4）。此外，该研究也S20、S22和S24单独替换为D时，锰供应对NRAMP1膜定位的影响，发现也是S20D时NRAMP1细胞内化不随锰供应所改变。说明S20的磷酸化就足够调控锰诱导的NRAMP1内吞作用。图4S20A、S22A和S24A替换后NRAMP1-GFP的亚细胞定位

小结

该研究发现缺锰时NRAMP1定位在细胞膜，锰的重新供应诱导NRAMP1在S20的磷酸化进而促进由网格蛋白介导的内吞作用，进而增强植物对锰毒的抗性。该研究揭示了植物响应外界锰有效性的机制，也是蛋白磷酸化修饰在逆境胁迫应答上新的体现。原文链接：


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