多面抗抑——肉苁蓉总苷缓解抑郁样行为:植物化学物质与肠道微生物的双向作用

汇报人：硕士研究生二年级王佳丽

研究背景

抑郁症是一种慢性、反复发作并可能危及生命的精神障碍，影响全球20%的人口。在中医理论中，肾阳不足会导致机体神智失常、气滞郁结，表现出情绪低落、兴趣减退、多愁善感等症状；这与现代医学中的抑郁症症状类似，提示传统补肾阳类药物可能具有潜在的抗抑郁活性。

上海交通大学李晓波教授课题组研究了肉苁蓉抗抑郁的药效物质及作用机制。相关文章TotalglycosidesfromstemsofCistanchetubulosaalleviatedepression-likebehaviors:bidirectionalinteractionofthephytochemicalsandgutmicrobiota于年1月发表在Phytomedicine杂志上。

研究内容

01

肉苁蓉不同组分的化学分析

取肉苁蓉粉末，用水（1:10，w/v）在80~90℃提取2h，重复3次，获得肉苁蓉提取物（CTE，得率57.1%）。将CTE溶解于蒸馏水中，然后用乙醇（1:4，v/v）缓慢搅拌并置于4℃下静置24小时。然后，rpm离心20min，收集沉淀和上清液；沉淀用80%乙醇洗涤，经Sevage法脱蛋白，得肉苁蓉总多糖（TP，得率为5.7%）。剩余的上清液在D微孔树脂柱上层析，用水和40%乙醇洗脱。水和40%乙醇洗脱部分分别得总寡糖（TO，得率35.1%）及总苷（TG，得率12.1%）。用蒸馏水和5%、10%和40%乙醇经D微孔树脂进一步洗脱TG，5%和40%乙醇洗脱组分别为总环烯醚萜苷（TG-IrG,得率2.7%）及总苯乙醇苷（TG-PhG,得率8.7%）。

应用UPLC-QTOF-MS对肉苁蓉主要成分进行了表征，共鉴定出21种成分，其中苯乙醇苷16种，酚苷2种（肉苁蓉提取物、肉苁蓉总苷、肉苁蓉总苯乙醇苷中存在）；环烯醚萜苷类3种（肉苁蓉提取物、肉苁蓉总苷、肉苁蓉总环烯醚萜苷）。肉苁蓉中总苷的相对含量为87.7%。相应地，苯乙醇苷和环烯醚萜苷分别占肉苁蓉总苯乙醇苷和肉苁蓉总环烯醚萜苷的86.7%和53.4%。各组分中松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、8-表马钱子酸、京尼平苷酸的含量见表1。

02

肉苁蓉不同组分及其典型代谢产物对小鼠绝望模型、慢性不可预知刺激模型的影响

图1

动物实验流程图（CUMS：慢性不可预知刺激；OFT：旷场试验；TST：悬尾试验；FST：强迫游泳试验；SPT：蔗糖偏好试验）

图2

从CTE中分离不同组分及肠道菌群典型代谢产物对小鼠FST、TST、OFT的影响

从CTE中分离的不同组分和肠道微生物群的典型代谢物对小鼠行为绝望测试的影响如图2所示，与对照组相比，服用7天丙咪嗪（阳性对照）的小鼠在FST和TST中的不动时间均显著减少，对OFT中的总行驶距离没有显著影响。CTE、TG和HT组也有类似的变化，提示CTE、TG和HT具有抗抑郁作用。有趣的是，与对照组相比，TG-PhG和TG-IrG给药后FST中的不动时间没有显著变化，TG-PhG给药后TST中的不动时间没有显著变化，这表明苯乙醇和环烯醚萜苷间的协同作用是CTE发挥抗抑郁作用的基础。

CTE不同组分及肠道代谢产物羟基酪醇HT对慢性不可预知刺激模型大鼠的行为学的影响与绝望模型结果一致。因此，TG和HT分别是从CTE和肠道微生物群中分离出来的主要生物活性组分和典型代谢物。

图3

不同组分及HT对血清中皮质醇（CORT）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、促肾上腺皮质激素释放激素（CRF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,白介素-1β（IL--1β）,干扰素-γ（INF-γ）及海马中5-羟色胺（5-HT）、脑源性神经营养因子（BDNF）、TNF-α水平的影响。（n=8-9/组）。方差分析，与对照组比较，##p0.01，###p0.；与CUMS组比较，*p0.05，**p0.01，**p0.；与TG组比较，Δp0.05

与对照组相比，CUMS模型组血清中的CORT、CRF、ACTH、TNF-α、IL--1β、INF-γ海马中TNF-α的水平显著升高,海马5-HT和BDNF水平显著降低，如图三所示。除氟西汀FLX组与CUMS组，海马区BDNF水平无显著差异外，CUMS大鼠接受氟西汀、CTE、TG、HT后上述变化均能显著逆转（p0.05），表明CTE、TG、HT能够减轻HPA轴的过度激活，改善外周和神经的炎症，及海马中5-HT和BDNF的缺乏。同样地，TG-IrG和TG-PhG治疗显著降低了血清CORT、TNF-α,INF-γ,以及海马TNF-α,提高CUMS大鼠海马5-HT水平。TG-IrG组血清CRF和ACTH水平较CUMS组明显降低。有趣的是，TG-PhG组和TG-IrG组血清CORT，TNF-α,ACTH和CRF明显高于TG组（p0.05），而海马5-HT和BDNF的表达则相反（p0.05）。结果表明，TG-PhG和TG-IrG对HPA轴亢进、外周和神经炎症、5-HT缺乏的作用明显低于TG，提示苯乙醇苷和环烯醚萜苷可能在上述多方面发挥协同作用。

TG和HT调节CUMS大鼠的HPG轴和环核苷酸代谢。测定了CUMS大鼠血清中T、GnRH、cAMP和cGMP的水平以及cAMP和cGMP的比值（cAMP/cGMP），结果见表2。与对照组相比，CUMS组血清T、GnRH、cAMP及cAMP/cGMP浓度显著降低，cGMP水平显著升高（p0.05），提示CUMS可导致HPG轴抑制和环核苷酸代谢紊乱。与CUMS组比较，FLX组无明显变化。TG和HT治疗后，血清T、GnRH、cAMP和cAMP/cGMP水平显著升高（p0.05），而cGMP水平显著降低（p0.05）。这些结果表明，TG和HT对HPG轴和环核苷酸代谢有调节作用，明显优于阳性对照氟西汀。

表2TG和HT对CUMS大鼠的HPG轴和环核苷酸代谢的影响

03

肉苁蓉不同组分及其典型代谢产物与肠道的相互影响

实验组之间的结肠形态无显著差异（图4a）。此外，还分析了TG和羟色胺对结肠炎症和肠屏障破坏的影响（图4b-d）。与对照组相比，CUMS组杯状细胞数量减少，粘液层厚度减少，ZO-1的蛋白表达减少和IFN–γ、TNF-α水平升高。结果表明，虽然未引起明显的组织学损伤，但CUMS可导致结肠轻度炎症和肠屏障破坏。经氟西汀、TG、HT处理后，结肠黏膜杯状细胞增多，粘液层增厚，IFN–γ、TNF-α显著降低（p0.05）。此外，TG和HT使ZO-1蛋白表达显著增加（p0.05），达到与对照组相似的水平。结果表明，TG和HT能减轻CUMS大鼠结肠轻度炎症和肠屏障破坏。

图4

TG、HT和FLX对大鼠结肠中细胞形态学改变及相关因子的影响（a）HE染色切片（b）AB-PAS染色切片（c）ZO-1免疫组化切片（d）ZO-1、IFN-γ、TNF-α的定量结果。

图5

盲肠标本肠道菌群多样性、组成及差异分析（a）各组α多样性指数（b）大鼠盲肠标本16sRNAPCoA图（c）所选门的相对丰度在各组间有显著差异（d）对照组与CUMS组在属水平上的LEfSe分析（e）各类群间差异显著的所选属的相对丰度热图

α多样性（图5a）和β多样性（图5b）结果表明，尽管盲肠内容物中肠道微生物群的丰富度（Chao）和多样性（Shannon）没有差异，主坐标分析（PCoA）图中肠道微生物群的整体结构表明对照组和CUMS组之间存在显著差异。此外，TG和HT处理显著增加了CUMS大鼠的细菌丰富度，并导致PCoA图与CUMS大鼠相比存在显著差异，与对照组有明显相似之处。微生物群的分类变化进一步证实了TG对肠道微生物群组成具有显著的调节作用。给予TG后，CUMS大鼠的大多数改变类群的丰度被逆转到与对照组相似的水平。与CUMS组相比，TG组厚壁菌门和拟杆菌门的丰度分别显著降低（14.2%，p0.05）和富集（53.6%，p0.05）（图5c）。TG组丹毒菌科（厚壁菌门，78.4%，p0.05）和鼠杆菌科（拟杆菌门，77.3%，p0.05）的丰度显著增加。在属的水平上（图5d），厌氧菌、Harryflintia、反刍梭菌属、未分类反刍科（反刍科的成员）和消化球菌属（消化球菌科的成员）的丰度显著降低，而丹毒霉科、异杆菌，TG组的杜氏菌（丹毒菌科成员）和诺兰克氏菌（鼠杆菌科成员）的丰度高于CUMS组（p0.05）。与TG不同，HT降低了由CUMS诱导的部分改变的分类群的丰度，包括瘤胃科，3个属（Anarotruncus、Harryflintia和Ruminiclostridium_）归属于瘤胃科，2个属（Tyzzerella_，Acetififactor）归属于Lachnospiraceae科。这些结果表明，TG和HT对肠道菌群组成的调节有明显的差异，TG的作用优于TG，尤其是在改变丹毒科、消化球菌科和鼠杆菌科的属方面。

图6

改变的微生物菌属与血清中HPA轴相关激素、血清、结肠、海马中的促炎细胞因子以及海马中5-HT和BDNF的spearman相关性分析

为了阐明受TG和HT对肠道微生物群组成变化与抑郁症相关特征之间的关联，进行了Spearman相关分析。如图6所示，海马中5-HT和BDNF的水平仅与norank-f-Muribaculaceae显著正相关，改变的微生物属与HPA轴相关激素之间有明显的相关性。特别是杜氏菌、鼠杆菌科、丹毒杆菌和消化球菌与HPA轴功能密切相关。血清CORT、CRF、ACTH与杜氏菌、鼠杆菌科、丹毒菌呈负相关，与消化球菌呈正相关。此外，Dubosiella和norank-f-Muribaculaceae与结肠IFN-γ以及海马TNF-α呈负相关,异杆菌、哈利氏菌与血清和海马TNF-α也存在相似的关系。相反，消化球菌与结肠INF-γ血清TNF-α呈正相关。同样，norank-f-Lachnospiraceae血清INF-γ、TNF-α呈正相关。这些结果表明，TG影响的被改变的微生物属，特别是丹毒科、消化球菌科和鼠杆菌科的某些属，同时与HPA轴相关激素和促炎细胞因子有很强的相关性，证明肠道微生物群在调节HPA轴功能和炎症中的关键作用。

04

肉苁蓉不同组分及其典型代谢产物对色氨酸-犬尿氨酸代谢的影响

图7

TG、HT和FLX对CUMS大鼠血清色氨酸、犬尿氨酸及Kyn/Trp的影响

图8

TG、HT和FLX对CUMS大鼠结肠和海马IDO1蛋白表达的影响（a）蛋白质印迹分析（b）结肠IDO1蛋白表达柱状图（c）海马IDO1蛋白表达柱状图

与抑郁密切相关的神经递质5-羟色胺（5-HT）的合成原料色氨酸有两条不同的代谢通路，分别是犬尿氨酸和5-HT通路，其中90%的色氨酸通过犬尿氨酸代谢。吲哚胺2,3双加氧酶（indoleamine2,3-dioxygenase,IDO）是犬尿氨酸通路的第一个限速酶，将底物色氨酸催化生成犬尿氨酸。IDO是炎症诱导型酶，可被多种炎性因子所诱导，且细胞因子间具有协同效应。其中IFN-γ和TNF-α是其强诱导剂。机体免疫系统激活引起细胞因子的过度分泌，诱导激活IDO，使色氨酸沿犬尿氨酸通路代谢增加，从而竞争性拮抗5-HT的生物合成过程，影响中枢神经传递。因此，较低的色氨酸水平和较高的Kyn/Trp在抑郁症中很常见。

TG和HT对大鼠血清色氨酸和犬尿氨酸水平以及结肠和海马IDO1表达的影响。如图7和图8所示，与对照组相比，CUMS组血清色氨酸水平显著降低，而结肠和海马的犬尿氨酸、犬尿氨酸与色氨酸比值（Kyn/Trp）和IDO1蛋白表达水平显著升高。FLX组血清Kyn/Trp较CUMS组明显降低。TG和HT处理使CUMS大鼠血清色氨酸水平显著升高，血清kynurenine和Kyn/Trp水平显著降低。此外，TG显著抑制CUMS大鼠结肠IDO1蛋白的表达，而海马IDO1蛋白的表达在CUMS组和TG组之间无显著差异。而HT对CUMS大鼠结肠和海马IDO1蛋白表达的影响与TG相反，提示TG和HT分别通过降低大鼠结肠和海马IDO1的表达来抑制色氨酸-犬尿氨酸代谢。

总结与思考

作者采用两种不同的动物模型，首次筛选出肉苁蓉中能减轻抑郁样行为的生物活性化合物—肉苁蓉总苷。以往对肉苁蓉研究大多集中在含量最高的苯乙醇苷上，而忽略了含量较少的环烯醚萜苷等成分。作者的研究表明，苯乙醇和环烯醚萜苷对HPA轴的过度激活、外周和神经炎症以及海马神经营养因子的缺乏具有协同作用。这些结果提示我们中草药中的微量成分也可能发挥关键的药理作用。

该研究进一步详细阐明了肠道菌群在TG起效过程中的关键作用：一方面，TG可通过调节Erysipelotrichacea、Peptococcaceae及Muribaculaceae科中系列菌属进而缓解HPA轴激活状态及炎症水平，并抑制色氨酸-犬尿氨酸代谢发挥抗抑郁作用；另一方面，TG经肠道菌群代谢后产物羟基酪醇（HT）亦被证实是其体内活性物质之一。该研究还发现TG可缓解抑郁样大鼠体内下丘脑-垂体-性腺轴低下及环核苷酸异常，多角度阐释了肉苁蓉抗抑郁的药效物质及作用机制。

参考文献：

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